Calibradores e Controles Parte 2

Calibradores e Controles Parte 2

Fala comigo, Bioclientes.

Oi pessoal, tudo bem? Espero que nosso último Bioclin On Cast tenha sido útil para esclarecer alguns pontos importantes e relevantes sobre o uso de Calibradores e Controles na rotina diagnóstica.

Hoje estamos aqui para continuar este assunto falando mais especificamente sobre as linhas de Elisa e Biologia Molecular.

De uma forma geral, se você entendeu os conceitos abordados na última postagem, vai perceber que o que vai ser apresentado hoje não é muito diferente. A função dos Calibradores e Controles vai continuar sendo a mesma.

Controles e Calibradores

Vamos começar a falar agora dos produtos da linha Biolisa?

A linha Biolisa da Bioclin, amplamente conhecido como Elisa, utiliza método imunoenzimático para a detecção de anticorpos ou antígenos para vários patógenos, dentre eles, as Hepatites Virais, HIV, Chagas e para a linha TORC, Toxoplasma, Rubéola e Citomegalovírus.

Nós temos kits para a realização de testes qualitativos, quantitativos e até mesmo alguns que  realizam ambos os testes com o mesmo produto, como os produtos para a detecção de IgG da linha TORC.

Mas afinal o que são testes qualitativos e testes quantitativos?

Os produtos utilizados para a simples detecção de anticorpos ou antígenos são chamados qualitativos, e os seus resultados são dados como positivo, negativo ou indeterminado.

Já os produtos que além da detecção fazem a quantificação dos anticorpos/antígenos são chamados quantitativos, e os resultados são dados em concentração.

Os testes qualitativos possuem basicamente um Controle Positivo e um Controle Negativo, com exceção dos kits da Linha TORC que apresentam ainda um terceiro controle chamado de Calibrador Cut-Off, que como o seu próprio nome diz, é utilizado como referência de valor de corte para a determinação dos resultados das amostras testadas.

Os testes quantitativos além dos Controles Positivo e Negativo tem em sua apresentação os Padrões de Referência, os quais tem valor de concentração definido e são utilizados para criar uma curva de calibração. Assim, a concentração das amostras em teste é determinada através da interpolação de suas absorbâncias dentro da curva de calibração.

O Controle Positivo e os Padrões de Referência são compostos basicamente por anticorpos reativos ou antígenos específicos para cada patógeno em análise, com exceção do Controle Negativo que contém anticorpos não reativos. Estes reagentes têm uma faixa de valor de absorbância definido para cada produto e são utilizados como parâmetros de qualidade para a validação da técnica, ou seja, se o teste realizado apresentou os resultados esperados de acordo com o fabricante.

Quando o kit é submetido a condições inadequadas de uso, transporte ou armazenamento estes Controles e Padrões podem ser contaminados ou sofrer degradação, o que pode proporcionar resultados falsos que invalidam o ensaio.

Então, vamos falar agora um pouco da linha de Biologia Molecular?

A linha Bio Gene é constituída de produtos para diagnóstico molecular qualitativo e quantitativo de agentes infecciosos e de alterações genéticas humanas relacionadas a doenças, baseado na metodologia de PCR em tempo real.

Nossa lista de produtos inclui kits para diagnóstico de Dengue, Zika, Chikungunya, além de CMV e HPV Alto Risco, todos com altíssima sensibilidade e especificidade.

O diagnóstico feito por PCR em tempo real baseia-se no fato de que, sob condições especiais, é possível induzir uma reação em cadeia da polimerase.

O que isso significa? Significa que a presença de algumas moléculas de DNA ou RNA de interesse podem ser amplificadas, ou seja, podem ser copiadas milhares de vezes, e essa amplificação é detectada através de sondas fluorescentes específicas em um equipamento de PCR em Tempo Real.

Agora que sabemos o princípio da técnica, temos que entender como o processo é controlado para garantir resultados confiáveis.

Nossos kits apresentam 3 Controles, são eles: o Controle Interno, Negativo e o Padrão A, este último também pode ser utilizado como Controle Positivo nos testes qualitativos.

O Controle Interno é basicamente um controle exógeno, ou seja, um plasmídeo encapsulado com uma sequência conhecida que é adicionado às amostras durante o passo de extração dos ácidos nucleicos.

Este Controle tem uma faixa de valor de CT definida entre 25 e 31, e permite a avaliação do método ou kit de extração utilizado, assim como da PCR ou amplificação realizada. Através deste controle é possível detectar falhas no processo de extração ou da PCR, por exemplo, uma amostra positiva que sofreu degradação durante a extração de DNA ou RNA, provavelmente apresentaria um resultado falso negativo após a PCR.

No entanto, neste caso o Controle Interno também sofreria degradação e resultaria em um CT fora da faixa permitida o que invalidaria o teste sendo recomendada assim uma nova extração desta amostra.

O Padrão A é constituído de um plasmídeo sintético contendo a sequência do gene alvo que se deseja amplificar. Ele possui concentração definida de 2 x 105 cópias por microlitro, e é o primeiro ponto da curva.

Os outros pontos B, C e D são preparados a partir da diluição seriada do Padrão A numa ordem de 10 vezes.  Dessa forma, no final da diluição teremos o Padrão A com concentração de 2 x 105, o Padrão B com 2 x 104, o Padrão C com 2 x 103 e Padrão D com 2 x 102 cópias por microlitro.

Através dos Pontos com as concentrações conhecidas, o equipamento plota uma Curva Padrão e calcula a concentração do patógeno. Além da concentração, outros parâmetros devem ser avaliados para considerar a Curva Padrão adequada, entre eles a eficiência da curva que deve variar entre 90% e 110% e um valor do Coeficiente de Correlação entre 0,99 e 1,00.

Quando o patógeno está presente na amostra, o sinal fluorescente é amplificado e posteriormente detectado dentro dos pontos da Curva Padrão. Se a quantidade do patógeno na amostra for muito grande, a amplificação será precoce e a amostra vai apresentar um valor de CT baixo. Caso contrário, se a carga de patógeno for muito baixa mas ainda assim dentro do limite de detecção do kit, a amplificação ocorrerá de forma tardia resultando em um valor de CT mais alto.

Para testes qualitativos, onde só é necessário saber se há presença de infecção ou não, é utilizado o Padrão A como Controle Positivo e Controle Negativo. Se houver amplificação na amostra, o resultado é considerado positivo. Caso contrário, deve ser interpretado como negativo.

Diferente das linhas de Bioquímica e Elisa, é sempre recomendado que as corridas sejam realizadas com a presença dos Controles para evitar resultados super ou subestimados, principalmente nos testes quantitativos.

É sempre recomendando antes de utilizar os produtos ler previamente a Instrução de Uso e seguir a técnica conforme descrito para garantir resultados confiáveis e reprodutíveis.

Então pessoal, espero ter esclarecido mais algumas dúvidas a respeito do uso correto de Calibradores e Controles em nossa rotina do diagnóstico. Em caso de dúvidas, entre em contato conosco através dos nossos canais de atendimento: bioclin.com.br ou através do nosso SAC: 0800 031 5454

Então, bom trabalho a todos e continuem acompanhando o Bioclin On Cast, o podcast do diagnóstico.

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